6-OHDA损毁建立“完全”损伤PD模型

   帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种发生于人类中老年中枢神经系统的疾病，动物并不自然发生该病。给动物使用不同的神经毒素如6-羟基多已胺。甲基安非他明、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢砒啶（MPTP）以及Fe2可模拟出该病的某些特征。PD的运动症状和相应的病理变化可在动物如小鼠、大鼠、灵长类等观察到，大量的研究表明，中脑双侧苍白球和黑质DA能神经元坏死是PD的主要病理学改变。

    制备PD大鼠模型用液体
    称1.8毫克6-OHDA，溶于含0.2％抗坏血酸的0.9％氯化钠溶液600ul中（浓度为3mg/ml），分装，-20℃避光保存，贮存不宜超过10天。使用时从-20℃中取出，置于冰上，避光，30分钟内用完。

b．操作步骤

   Wistar大鼠，雌雄均可，体重200-250g。10％水合氯醛（4℃存放，不宜过久）3ml/kg，腹腔注射麻醉。约5分钟动物麻醉平稳后，将动物俯卧位固定于小动物立体定位仪上。上耳杆时注意对称和稳固，上牙齿固定于门齿棒上，并用压杆压往鼻骨。剪去头部顶毛，切开或剪开皮肤，范围为：两外耳道中线连线前后各0.5厘米。用眼科剪去除颅骨表面的结缔组织膜或用手术刀刮去，以使颅骨表面尽可能干净。少量出血时用于棉球压迫止血。稍候干燥，可见到颅骨表面呈白色，前囟、后囟清晰可见。

将注射用的10ul或25ul Hamilton微量注射器固定于立体定位注射仪上颅骨正上方，准备好牙科钻头，钻头直径0.8m1。损毁部位为单侧黑质或内侧前脑束。以前囟为标准参考点，进针点可选择左侧或右侧。有时前囟不清晰，可分别按压两侧的顶盖骨和额骨，在“按压一放松”的过程中，便可清晰见到前囟。依Paxson《The Rat Brain》图谱，注射部位的坐标为：第一点（mfb），门齿棒高于耳杆3.4mm。前囟后4.0mn1，中线左旁开0.8mm，颅骨表面下8.0mm：第二点（SNC），门齿棒低子耳杆2.3mm，前囟后4.l4mm，中线左旁开1.2mm，颅骨表面下7.8mm。用牙科钻钻开颅骨恰至软脑膜表面。用小号针头轻轻挑破软脑膜。此时注意最好不要用钻头直接钻破软脑膜，以免大量出血。每点注射6-OHDA溶液4ul（12ug），注射速度为lul／min，留针10分钟，缝合皮肤，将术后的大鼠置于安静保温处直至清醒，自由进食饮水。

c.模型检测

    行为学检测：依照国际通用的标准（Hudson等，1993），对注射过6-OHDA的大鼠，于术后第二周开始筛选。即每周一次腹腔注射APO（0.25mg／kg体重）诱导其向健侧旋转，共筛选3周，每次记录30分钟，旋转210圈以上者为PD大鼠。

    病理学检查：模型成功的动物，10％水合氯醛过量麻醉，开胸，经心脏从胸主动脉滴入（或经恒流泵输入）0.1mol／L的磷酸缓冲液（pH7.3-7.4)）或l％的多聚甲醛（磷酸缓冲液配制）100-150m1，然后继续输入4％多聚甲醛（磷酸缓冲液配制）200ml以进行内固定。全脑取出后，继续在4％多聚甲醛溶液中浸泡24小时以上进行外固定。然后经30％蔗糖置换后，OCT包埋，快速冰冻切片，片厚10um。常规病理学检查，或进行酪氨酸羟化酶（tyrosine droxylase，TH）的免疫组化染色，观察DA神经元的数目。可见损伤侧黑质致密部DA神经元明显缺失，胶质细胞增生，残留神经细胞固缩，部分胞浆明显肿胀和空泡变。同侧纹状体内DA神经元末梢的TH反应性大为降低甚至消失。生理盐水对照组上述部位DA神经元与未受损侧相比，无显著差别。尾核、豆状核可无明显特异性改变。

    生化检查：动物迅速断头取脑，速冻至-70℃。采用立体定位方法穿刺得到损伤侧与未损伤侧纹状体组织标本（湿重大约0.3mg）。高效液相电化学法（HPLC-ECD）检测中脑黑质、纹状体DA、高香草酸（HVA）和3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC）的含量。可见受损侧上述部位的DA、HVA、DOPAC含量均降低。

    实验数据统计分析方法：旋转行为及DA等含量测定结果采用配对，检验。

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