乳鼠心肌细胞培养操作规程
乳鼠心肌细胞培养操作规程
一、目的
正确使用心肌组织中分离心肌细胞的方法和程序，掌握组织取材、剪切、细胞分离、混匀、计数、接种和器械使用等的操作要领、方法，按照无菌操作技术进行乳鼠心肌细胞培养。
二、原理
乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞。心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%，用酶消化法将心肌组织碎块经纯化分离成单个心肌细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，内心肌细胞可达95%，在体外适宜条件下，使心肌细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。在乳鼠心肌细胞培养实验中能直接观察到培养心肌细胞生命活动的动态过程，还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。
三、主要操作规程
（一）试剂配制
1、D-Hanks 液(g/L)： KCl 0.40，KH2PO4 0.06，NaCl 8.00，NaHCO3 0.35，Na2HPO4·12H2O 0.13，酚红0.02。以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH 调整溶液pH 值至7.0-7.2，每瓶100 mL 分装，4℃冷藏备用。
2、0.125%胰蛋白酶：0.125 g 胰蛋白酶干粉溶于100mL D-Hanks 液中，搅拌2h，4℃冰箱放置过夜，每瓶8mL 分装，-20℃冷藏备用。
3、DMEM 培养基：DMEM 干粉(1L 量)溶于500mL 三蒸水中，充分搅拌溶解，将3.0g NaHCO3 溶于少量三蒸水中，混合，定容至1L 后调pH 值至6.8-7.0，每瓶80mL 分装，4℃冷藏备用。
4、双抗液配制：100 万U 硫酸链霉素溶于l0mL Hanks 液中，80 万U 青霉素粉溶于8mL 上述硫酸链霉素的Hanks 液中，配成每毫升含青霉素、链霉素各10 万U 的母液。使用时，在100 mL 培养基中加母液0.1 mL，则培养基内青霉素、 链霉素终浓度为100 U/mL。
5、胎牛血清：胎牛血清在56℃水浴中灭活30min，青霉素小瓶分装，-20℃保存备用。将20mL 胎牛血清加入80mL DMEM 中，配成终浓度为含20%胎牛血清的DMEM。
6、PBS 缓冲液：KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 2.08g溶于1000mL 三蒸水中。
（二）消毒准备
先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素取出解冻。其余未冻药品提前20分钟取出来与室温平衡。新洁尔灭（0.1％）纱布（用10 mL 5％的新洁尔灭加水至500 mL）消毒地面（1：500的84液），用酒精棉球擦拭超净工作台台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开风机吹至实验结束。
（三）细胞培养
1、把两个5 mL注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5 mL 的 DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠放入 0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。
2、取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁，铺纱布、换手套。
3、用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5 mL的胰酶，然后将其中少许放入50 mL的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成 1 mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。
4、把温度计和三角烧杯放入250 mL烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35 ℃） 和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行，一定要注意监控）。
5、温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升。
6、10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2 mL上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。
7、接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，800或1000转，打开关。
8、同时向三角烧瓶中加入5 mL胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2 mL DMEM液。
9、取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2 mL的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入 4 mL的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加5 mL的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。
10、消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。
11、离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3 mL（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4 号）吹打均匀。
12、取出24孔培养板接种，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。（24孔板，每孔最多加2 mL，一般加液时每孔加1~1.5 mL。（四）试剂和器材
1、试剂：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、小牛血清、碳酸氢钠液、盐酸液。
2、器材：
CO2 培养箱，超净工作台， XSZ-D 型倒置生物显微镜，高速冷冻离心机；
小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）、瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]、250 mL烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150 mL左右，消毒小鼠]、500 mL烧杯1个，用作废液缸、50 mL烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）、三角烧杯（50 mL）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）、离心管及帽（12-14个）、两个试管、吸管 （5~8个）、大镊子 （两把，持物，例夹棉球等）、24孔板、离心机；
超净台面放置的有：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）、75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）、大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250 mL烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）、1个500 mL烧瓶（废液缸）、温度计、 pH试纸（事先调pH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）、1 mL 2个（双抗液）、20 mL备用 2个、微量加样器 1000 mL及500 mL，以上物品均用紫外线照30分钟。
四、关键词：乳鼠； 心肌细胞 ； 细胞培养
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