（武汉药生动物养殖有限公司）

 缺血再灌注损伤(IRI)是器官移植、休克、动脉搭桥术后等普遍存在的问题。肾脏是发生IRI极为常见的器官之一，尤其肾移植，不可避免的要经历一定程度的IRI,肾脏缺血再灌损伤是急性肾衰的常见原因。对麻醉动物的肾动脉进行阻断和再通后，可引起肾脏缺血再灌注损伤。在缺血再灌注过程中，钙超载、线粒体能量合成障碍、氧自由基的增多等因素导致肾小管内皮细胞脱落，肾脏组织结构的破坏进而使肾脏功能发生障碍。

  1.实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，体重为220g~250g。

  2 实验分组：

实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

 3. 模型周期

    24h、72h

  4.建模方法

1  选取250g左右大鼠，术前禁食12h，自由饮水。

2  15％水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉,大鼠背部去毛，消毒备皮。 

3  在背部脊椎旁1cm、肋骨下缘1cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏, 小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 

4  缺血60min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 

5 分两层缝合开口,待大鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察大鼠状态及死亡情况并做好记录。

6  对照组不做缺血处理，其他操作相同。

7  分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻醉大鼠，下腔静脉取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。

5.模型的评价

1 血清生化指标检测： 

取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。

2 肾系数检测

 摘取双侧肾脏后，生理盐水冲洗，称重计算肾系数。

肾系数=双侧肾重（mg）/体重（g）

3 病理组织学检测：

4％多聚甲醛溶液固定48h。常规组织脱水、透明、浸蜡 、包埋。石蜡切片进行HE染色和PAS染色。

对照组大鼠肾小球、 肾小管及肾间质结构基本正常。在模型组，随着再灌注时间的延长呈现不同程度的肾脏病理改变，可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，出现水样或空泡变性，刷状缘消失，部分肾小管上皮细胞凝固性坏死、脱落，腔内可见管型，并可见间质水肿，间质内灶性炎症细胞浸润，肾小球病变不明显。每张切片×200 倍镜下取外髓质部 10 个视野，按 0 = 正常，1 = 轻微损伤(受损肾小管< 5%) ，2= 轻度损伤(受损肾小管 5 %～25 %) ，3 = 中度损伤(受损肾小管 25 %～75 %) ，4 = 重度损伤(受损肾小管> 75 %) 作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数

4 细胞因子的检测

ELISA 法检测血清 TNF-α、IL-6 含量, 模型组大鼠血清 TNF- α 和 IL- 6 含量在各时间点均显著高于对照组，其中24h为最显著。

6  注意事项

6.1 分离肾脏时不要损伤肾脏及其他器官

6.2  缺血要一次成功否则会造成缺血预处理而减轻损伤

6.3  缺血和应可见肾脏先变白一段时间后变暗发紫

图1 大鼠肾脏缺血再灌注手术操作图（动脉夹夹闭两侧肾动脉，缺血60min后松开动脉夹）