整体试验服务--动物疾病模型构建--大鼠脑缺血模型
武汉云克隆诊断试剂研究所
整体试验服务--动物疾病模型构建--大鼠脑缺血模型
大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion,MCAO) 是目前最常用的局灶性脑缺血模型,MCAO 模型先阻断颈外动脉(ECA)及其分支,且阻断翼腭动脉(PPA),以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA插入尼龙线,经颈内动脉(ICA)到大脑前动脉(ACA),机械性阻断大脑中动脉(MCA)发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线,恢复血流,实现再灌注。 线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点,用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性,药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想,同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点,适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素,可避免实验结果的不稳定性。
1.实验动物
SPF级Wistar大鼠,健康,雄性,体重为250g-300g。
- 实验分组
实验分六组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组,每组15只动物。
3.主要试剂
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride(sigma)
4.建模方法
1.15%水合氯醛麻醉大鼠,颈部备皮,消毒,插入肛温探头,保持体温在37±0.5℃。
2.颈部正中切口,暴露右侧颈总动脉,颈内动脉和颈外动脉。使用6-0丝线在距离颈总动脉分叉4mm处结扎颈外动脉远心端,在颈外动脉穿入另一根6-0丝线,在靠近颈总动脉分叉处打一个活结。
3.使用动脉夹夹闭颈总动脉。在距离颈总动脉分叉处3mm处的颈外动脉上剪一个小口,将一根头端处理过的0.33mm直径的尼龙线从小口中插入,进入颈内动脉,并向内插入大脑中动脉,尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约16±1mm。
4.缺血后90min拔掉线栓,用6-0丝线结扎外动脉近心端,用3-0丝线缝合颈部伤口,活力碘消毒伤口,将大鼠放在加热垫上,待清醒后放入恒温抚养箱饲养。
5.术后24h,对小鼠进行神经功能评分,然后腹腔注射15%水合氯醛麻醉大鼠,取大脑进行TTC染色和病理染色
5模型的评价
1.神经功能缺失体征评分
参考Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评分,分值越高,说明动物行为障碍越严重。
0分:无神经损伤症状
1分:不能完全伸展对侧前爪
2分:向对侧转圈
3分:向对侧倾倒
4分:不能自发行走,意识丧失
2.TTC染色
麻醉大鼠后,取大鼠脑组织,放入-20℃冰箱冷冻30min。用PBS配置1% TTC(W/V),37℃水浴至TTC溶解,将冻好的脑组织切片,置于10ml TTC溶液中,37℃恒温孵育10min。不时翻动脑片,使组织均匀染色。正常脑组织染色后呈鲜红色,而梗死区呈苍白色。
- 病理学评价
取脑后用4%多聚甲醛溶液固定,蔗糖溶液脱水后,经OCT包埋做冰冻切片,切片10um,做尼氏染色,可做梗死面积的评价。
尼氏体(Nissl body):是胞质内的一种嗜碱性物质,广泛见于各种神经元,但其形状大小和数量则各有差异。在生理情况下,尼氏体大而数量多,反映神经细胞合成蛋白质的功能较强,在神经元受损时,尼氏体的数量可减少甚至消失。
图1. TTC染色图(白色表示梗死组织,红色表示正常组织)
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