武汉云克隆诊断试剂研究所

整体试验服务--动物疾病模型构建--脂多糖（LPS）诱导的大鼠肺炎模型

内毒素是革兰氏阴性细胞外膜成分，主要致病物质是脂多糖（LPS），污染的空气、职业性粉尘(谷物粉等)、香烟中到处都有LPS，职业性和环境性的吸人一定浓度的上述物质后可引起或加重一系列临床病症，如哮喘、支气管肺炎等。急性肺损伤（ALI）是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭，主要病理特征为由肺微血管通透性增高而导致的肺泡渗出液中富含蛋白质的肺水肿及透明膜形成，并伴有肺间质纤维化，严重的ALI可最终发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），目前其发病机制尚未完全阐明。

1.实验动物

SPF级Wistar大鼠，雄性，体重为180g-220g。实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

2.主要试剂

LPS（Sigma公司）

3.建模方法

脂多糖（LPS）诱导的大鼠肺炎模型：将大鼠放入固定盒中，用酒精檫拭大鼠尾静脉后，按压住尾静脉1/3处，注射器进针后回抽有血后注入LPS溶液（溶于生理盐水，给药剂量10mg/kg），从而建立内毒素性急性肺损伤大鼠模型。正常对照组的大鼠做同样的操作，但向尾静脉注射等体积的生理盐水。

4.模型的评价

4.1肺损伤后的大体观察：

肺损伤后有肉眼可见肺部大面积出血渗出，可以直观的反映肺损伤程度。

4.2肺的湿/干重比：

肺的湿/干重比是反应肺水肿的直接指标，也是反应肺损伤严重程度的敏感指标。在急性肺损伤（acute lung injury, ALI）发生后，大量液体渗出至肺泡和肺间质，导致肺的重量增大，而肺的干重则不受影响。处死大鼠、剪断气管后取全肺，称湿重，然后将肺置于65℃恒温箱中干燥，24h 后取出称干重，计算肺湿/干重比值。

4.3肺损伤后的组织病理观察 ：

取左肺4%多聚甲醛固定，然后将肺组织常规脱水，石蜡包埋，切片（厚度为5μm），HE染色。HE染色肺组织学评价可以直观的反应肺损伤的程度，ALI组织病理学主要表现为肺泡中性粒细胞及红细胞的渗出，肺泡壁透明膜的形成。HE染色后可在低倍镜下观察到整个左肺组织的炎症细胞浸润、水肿以及损伤，评估肺部损伤分布情况；而高倍镜下则可以对肺泡结构进行辨认，对肺损伤程度进行评估和评分。

评分方法：取6个视野进行出血及水肿评分。

0分：没有损伤

1分：<25%的损伤面积

2分：25%~50%的损伤面积

3分：50%~75%的损伤面积

4分：>75%的损伤面积

4.4标志性炎症因子表达水平的检测：

左肺叶气管解剖，行支气管插管，预冷的(4度)无菌生理盐水l ml进行支气管肺泡灌洗3次，共3 m1，回收支气管肺泡灌洗液(BALF)至无菌离心管中， 1500 r／min，离心10 min，收集上清液，-80℃保存,使用ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-1β等细胞因子的含量。

4.5统计学处理

　应用SPSS软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（`x ±ｓ）表示，采用ｔ检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。

图1 模型组肺部取材大体图，肺部组织可见大面积出血渗出（↑）

表1  2组大鼠肺组织湿/干质量比（n=4 `x ±ｓ）

注：与对照组相比，*P<0.05

图2 HE染色结果可见对照组肺泡结构完整，肺泡壁无明显水肿，肺实质无明显炎性细胞浸润，模型组可见气管管腔内有大量的炎性细胞浸润，肺间隙可见大量的中性粒细胞浸润和红细胞渗出，炎性细胞明显。