武汉云克隆诊断试剂研究所

整体试验服务--动物疾病模型构建--小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型

缺血再灌注损伤，即缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。对麻醉动物的肝中叶和肝左叶的门静脉和肝动脉进行阻断和再通，由于肝脏中叶和左叶血流的阻断和再通，引起肝脏中叶和左叶明显的再灌注损伤。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP含量下降，导致肝细胞内外Ca^{2 +}重新分布，即Ca^{2 +}内流，引起线粒体的损伤。再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多，中性粒细胞的聚集，kupffer细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用，使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及结构破坏。

    1.实验动物

SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。

2. 实验分组：

    实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

3. 实验周期

    0h、3h、6h、12h、24h、72h

    4.建模方法

1 小鼠术前12 h禁食，自由饮水。

2 3%戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后将小鼠平躺在手术台上胶带固定四肢，将小鼠腹部术去毛，用碘酒和75％乙醇术区消毒。

3 取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏左、中叶之肝蒂（左、中叶肝脏供血的门静脉和肝动脉）。

4 用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后，与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将小鼠放在37℃恒温加热垫上保温。

5 完成持续缺血60min后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流，0.5min左右可见缺血区肝脏由白色逐渐恢复为鲜红色表明再灌注成功，逐层缝合腹腔肌肉和皮肤关闭腹腔，完成手术。待小鼠清醒后放回饲养室饲养，密切关注小鼠的状态及生存状况并做好记录。

6 术后分别于再灌注0h、3h、6h、12h、24h及72h麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。采用全自动生化分析仪检测血清中ALT（谷丙转氨酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）的水平。同时统一取肝左叶组织1．5cm×1cm×0．2cm留作病理标本或分生标本。

  5.模型评价

1 分别检测术后0h、3h、6h、12h、24h及72h小鼠血清中ALT（谷丙转氨酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）的水平。

2 统一取肝左叶组织1．5cm×1cm×0．2cm于4%多聚甲醛溶液中固定24h后脱水，包埋，进行石蜡切片后行HE染色，tunel染色。作坏死评分。肝小叶结构严重破坏，网状纤维支架塌陷，肝细胞坏死，空泡变样，肝细胞索、肝窦充血肿胀，边界不清，周围有炎性细胞浸润。

肝脏缺血损伤评分：

0分：无肝细胞损伤

1分：轻度损伤，特点为细胞质空泡化，病灶核固缩

2分：中度损伤，血窦膨胀，细胞溶质空泡化，细胞边界模糊

3分：中度到重度损伤，凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝锁，嗜伊红细胞增多，中性白细胞着边（附着于血管壁）

4分：严重坏死，失去肝脏结构，肝索崩解，出血，嗜中性粒细胞渗入

3 细胞因子的检测

肝脏损伤后，血清中TNFα、IFNγ、IL-2、IL-6、ICAM1等细胞因子的表达显著升高，可以用ELISA 法检测。

6 注意事项

6.1 分离肝门时用棉签分离，可避免对肝脏的损伤

6.2术前禁食有利于手术进行

6.3阻断血流要一次成功，否则会造成缺血预处理，减轻损伤程度

6.4取材时镊子不要损伤肝脏

图1 对照组小鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射性排列；肝脏缺血再灌注损伤小鼠自中央静脉周围开始坏死，肝细胞空泡样变性，炎症细胞浸润，少数肝细胞脂肪变性。