武汉云克隆诊断试剂研究所

整体试验服务--动物疾病模型构建--小鼠胆管结扎诱导的胆汁淤积模型

胆汁淤积性肝病在临床中较为常见，它可由多种原因引起，例如：肝细胞、毛细胆管、肝内胆管以及肝外胆管任何部位器质性或功能性异常，致使胆汁排泄障碍、胆汁流量减少、胆汁成分返流入血液中。胆色素在肝细胞组织中蓄积，引起一系列器质性损害，导致代谢紊乱和功能异常。此状态若持续发展将导致肝小叶和血管结构破坏、结缔组织隔形成，最终肝硬化，患者预后差。因此胆汁淤积性肝病小鼠模型的建立对于深入研究胆汁淤积性肝病具有重要意义。胆管结扎（bile duct ligation，BDL）模型结扎小鼠胆总管后，随时间延长肝脏对称性肿大，出现胆汁淤积表现。此模型造模方法简单、周期短，形成胆汁淤积稳定可靠，是研究胆汁淤积病机制和寻找治疗药物研究的理想模型 。

1.实验动物

 SPF级BalbC小鼠，健康，雄性，体重为18g~20g

    2.实验分组

    实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

3.实验周期

14d

4. 建模方法

1术前一晚禁食，自由饮水。

2称量小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠（3%）40mg/kg麻醉，仰卧位固定于手术台上， 手术视野消毒，去毛。

3 逐层沿腹正中线打开腹腔， 在十二指肠起始端找到胆总管并分离， 并于胆总管下方穿两根7-0 缝线， 分别结扎，并于结扎线中间剪断胆管，再用7-0 缝线缝合内层，5-0缝线缝合外层，将小鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。

4 待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。

5 对照组不做结扎处理，其他操作相同。

6 于术后14d取材。麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时统一取肝左叶组织1．5cm×1cm×0．2cm留作病理标本或分生标本。

5模型的评价

1 大体观察

模型组小鼠胆总管结扎后进食量减少，毛发散乱无光泽，少动并且对声、光刺激 反应减弱，尿液逐渐呈浓茶样改变。假手术对照组无上述异常改变 。肝脏大体标本BDL组小鼠肝脏明显肿大，肝包膜紧张、边缘钝、棕黄色，质稍硬。对照组则肝脏体积正常，包膜无紧张，质软，切面红润、细腻。

2 血清总胆汁酸是反应胆汁淤积的一个特异性指标。检测小鼠血清中总胆汁酸的水平。

3 统一取肝左叶组织1．5cm×1cm×0．2cm于4%多聚甲醛溶液中固定24h后脱水，包埋，进行石蜡切片后行HE染色，tunel染色。作坏死评分。肝小叶结构严重破坏，网状纤维支架塌陷，肝细胞坏死，空泡变样，肝细胞索、肝窦充血肿胀，边界不清，周围有炎性细胞浸润。

肝脏缺血损伤评分：

0分：无肝细胞损伤

1分：轻度损伤，特点为细胞质空泡化，病灶核固缩

2分：中度损伤，血窦膨胀，细胞溶质空泡化，细胞边界模糊

3分：中度到重度损伤，凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝锁，嗜伊红细胞增多，中性白细胞着边（附着于血管壁）

4分：严重坏死，失去肝脏结构，肝索崩解，出血，嗜中性粒细胞渗入

4 细胞因子的检测

肝脏损伤后，血清中TNFα、IFNγ、IL-2、IL-6、IL-12、ICAM1等细胞因子的表达显著升高，可以用ELISA 法检测。

图1 肝脏大体标本，正常对照组小鼠肝脏呈粉红色或绛红色，表面光滑；模型组小鼠肝脏肿大，色泽黄变，表面结构杂乱不规整。

图2 肝脏HE染色图  肝细胞坏死，空泡变样，胞质疏松呈网状，核消失，呈网状或羽毛状坏死；胆管上皮细胞水肿，坏死，周围有淋巴细胞浸润。