PCR芯片
1.PCR芯片介绍
实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法。通过在试验过程中,实时监测荧光染料的信号变化可反映出样品中的基因拷贝数,并且实时定量PCR线性范围广(能达到5个数量级),因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。但是,由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因,因而每次实验只能检测少数几个基因的表达水平,若要检测大量基因,则工作量巨大,耗时长久。通过简单的以及经过优化的实时定量PCR体系,PCR芯片随之开发出来,研究者可以同时研究大量基因,既可以进行某些特别感兴趣的信号通路的研究,也可以作为验证芯片结果的方法,PCR芯片可广泛用于生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域,是近年生命科学领域的研究热点之一。
2.操作步骤
采用PCR芯片进行实验只需2小时。PCR芯片实验过程:首先将RNA样品反转录为cDNA第一链,作为PCR模板;接着,将模板加入到反应体系(RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix)中。在已经固定好基因特异性引物的96孔板各孔中,加入等量的PCR反应体系,进行PCR反应。采用仪器配套的软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值(Ct)。最后,采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。通过分析看家基因Ct值的一致性,可确定合适的标准化方法。芯片所设置的对照,可以检测PCR体系中是否存在DNA污染,或者是否有影响反转录或PCR实验步骤的因素存在。
3.技术难度
采用PCR芯片开展研究,技术上的难点是如何在同一次实验中,相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率,并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度,特异性和可重复性。因此首先设计筛选出最佳的候选引物,接着通过实验,在不同反应条件下,检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合,最终获得了优化的引物和PCR反应体系,适应PCR芯片的要求。
4.检测数量
根据一次实验所检测样品数量的多少,可将PCR 芯片分为低通量和高通量 PCR 芯片。低通量PCR 芯片的载体为 96 孔或 384 孔 PCR反应板,仅须将制备好的样品cDNA加入相应的反应孔内,在荧光定量PCR 仪上进行扩增即可。在灵敏度方面,每次扩增仅需400 ng 总 RNA。但低通量PCR 芯片所检测的基因数量有限,而且无法进行多个样品的多个基因的并行检测。低通量PCR芯片使用时和通常的定量 PCR 操作步骤相同,即从待检的生物样品(细胞、组织、血液等)中提取总RNA 或分离出 mRNA→经反转录形成cDNA→将所得的cDNA 直接等量加入含有相应待检测基因引物的孔中→加入PCR mix→在荧光定量PCR 仪上进行 PCR 定量检测→数据分析。
高通量PCR 芯片是在固相载体上固定有成百上千个基因的特异性引物,并且可同时检测高达成百上千个样品,达到同时并行检测多个样品的多个基因表达的能力。因此,具有检测通量高、耗时短和样品用量少的优点。目前,由Applied Biosystems 公司研制的OpenArray SystemFluidigm 公司开发的BioMarkSystem将荧光定量PCR 技术与高通量芯片技术相结合,属于高通量PCR 芯片,但这些芯片必须在特定的定量PCR 仪器上使用进行。
5.优势
PCR芯片与常规PCR相比:1. 整体性,PCR芯片操作系统采用多基因扩增、结果分析一体化,操作简便;传统的PCR采用单基因扩增及结果分析,操作繁琐;2. 时间,PCR芯片检测多个基因的时间是过去PCR检测单个基因的时间;3. 试剂,传统PCR对试剂用量有要求,15微升以下就很难得到理想的扩增结果,PCR芯片可以扩增10微升以下的样品,这相应减少了试剂如Taq酶的用量,节省了实验经费也减少了废液污染。因此,与常规的PCR扩增技术相比,PCR芯片具有反应体积小、反应速度快、操作简便、价格低、样品用量少、无污染、节省试验成本、便于集成化、结果可靠的优点。
6.应用
使用PCR芯片技术进行基因表达(信号通路或多个相关基因)的检测,已普遍用于生命科学研究的多个领域,如疾病发病机制研究,并且PCR 芯片作为一种快速、准确的技术手段,可应用于药物机理研究中。
7.发展方向
PCR芯片不仅成本低,而且试样、试剂、人力三者消耗量均低, 速度也快, 灵敏度高。作为DNA分析的重要工序PCR,更是现代生物、医药不可或缺的部分,其没备的集成化,如样品预处理系统、分离系统以及检测系统等的集成使PCR芯片在生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域继续发挥重要作用。
8.启因服务技术
美国SABioscience公司是Qiagen旗下子公司,在Q-PCR array领域具有国际领先地位,目前SABioscience公司针对不同的信号通路和疾病相关基因设计了150多款功能分类芯片;
启因生物采用此种芯片,可提供种属包括人、小鼠、大鼠、果蝇、猪、兔、鸡等基因检测,格式分为96孔和4 x 96孔(384孔)两种。针对客户的需求,还有个性化定制芯片服务,因此PCR芯片技术服务利用就是SYBR Green荧光定量PCR技术,并在96或384孔板上同时检测一个信号通路或者一种疾病相关的84或372个基因的表达水平。
PCR芯片服务项目,部分列举如下:
Adherens Junctions | Liver Cancer |
Adipogenesis | Lung Cancer |
Aging | Lymphoma |
Allergy & Asthma | Macular Degeneration |
Alzheimer's Disease | Male Infertility |
Amino Acid Metabolism I | MAP Kinase Signaling Pathway |
Amino Acid Metabolism II | Mesenchymal Stem Cells |
AMPK Signaling | miR-1 & miR-206 Targets |
Androgen Receptor Signaling Targets | miR-9 Targets |
Angiogenesis | miR-17 & miR-20a Targets |
Angiogenic Growth Factors | miR-21 Targets |
Antibacterial Response | miR-29 Targets |
Antifungal Response | miR-34a1 Targets |
Antiviral Response | miR-146a Targets |
Apoptosis | miR-153 Targets |
Apoptosis 384HT | miR-155 Targets |
Atherosclerosis | miR-181 Targets |
Autophagy | miR-210 Targets |
Breast Cancer | miR-221 & miR-222 Targets |
Estrogen Receptor Signaling | miR-4514 & miR-4692 Targets |
cAMP / Calcium Signaling PathwayFinder | let-7 Targets |
Cancer Drug Resistance | Mitochondria |
Cancer Drug Targets | Mitochondrial Energy Metabolism Plus |
Cancer PathwayFinder™ | mTOR Signaling |
Cancer Stem Cells | Molecular Toxicology PathwayFinder |
Cardiotoxicity | Molecular Toxicology PathwayFinder 384HT |
Cardiovascular Disease | Multiple Sclerosis |
Cell Cycle | MYC Targets |
Cell Death PathwayFinderTM | Necrosis |
Cell Junction PathwayFinderTM | Nephrotoxicity |
Cell Lineage Identification | Neurogenesis |
Cell Motility | Neuronal Ion Channels |
Cell Surface Markers | Neurotoxicity |
Cellular Senescence | Neurotransmitter Receptors |
Cellular Stress Responses | Neurotrophins & Receptors |
Chemokines & Receptors | NFkB Signaling Pathway Plus |
Circadian Rhythms | NFkB Signaling Targets |
Common Cytokines | Nitric Oxide Signaling Pathway |
Crohn's Disease | Notch Signaling Pathway Plus |
Cystic Fibrosis | Notch Signaling Targets |
Cytokines & Chemokines | Nuclear Receptors & Coregulators |
Cytoskeleton Regulators | Obesity |
Dendritic & Antigen Presenting Cell | Oncogenes & Tumor Suppressor Genes |
Diabetes | Osmotic Stress |
DNA Damage Signaling Pathway | Osteogenesis |
JAK / STAT Signaling Pathway | Calibration Plate - Predispensed with Primer - Human |
Leukemia | Calibration Plate - Predispensed with PCR Cocktail Mixture - Human |
Let-7a Targets | Calibration Plate - With PCR Cocktail Mixture in Tube - Human |
DNA Repair | Osteporosis |
Dopamine and Serotonin Pathway | Oxidative Stress Plus |
Drug Metabolism | p53 Signaling Pathway |
Drug Metabolism: Phase I Enzymes | Pain: Neuropathic & Inflammatory |
Drug Metabolism: Phase II Enzymes | Parkinson's Disease |
Drug Transporters | Phagocytosis |
EGF / PDGF Signaling Pathway | PI3K-AKT Signaling Pathway |
Embryonic Stem Cells (Version Y) | Polycomb & Trithorax Target Genes |
Endothelial Cell Biology | Polycomb & Trithorax Complexes |
Epigenetic Chromatin Modification Enzymes | Polycystic Kidney Disease |
Epigenetic Chromatin Remodeling Factors | PPAR Targets |
Epithelial to Mesenchymal Transition | Pre-Eclampsia |
Extracellular Matrix & Adhesion Molecules | Primary Cilia |
Fatty Acid Metabolism | Prostate Cancer |
Fatty Liver | Protease Activated Receptor Signaling |
Female Infertility | Protein Phosphatases |
Fibrosis | Signal Transduction PathwayFinder™ |
Focal Adhesions | Skeletal Muscle: Myogenesis & Myopathy |
GABA & Glutamate | Stem Cell |
Gap Junctions | Stem Cell Signaling |
Glucocorticoid Signaling | Stem Cell Transcription Factors |
Glucose Metabolism | Stress & Toxicity PathwayFinder |
Glycosylation | Synaptic Plasticity |
G Protein Coupled Receptors 384HT | T Cell Anergy & Immune Tolerance |
GPCR Signaling PathwayFinder | T Helper Cell Differentiation |
Growth Factors | T-Cell & B-Cell Activation |
Heat Shock Proteins & Chaperones | Telomeres & Telomerase |
Hedgehog Signaling Pathway | Terminal Differentiation Markers |
Hematopoiesis | TGFb / BMP Signaling Pathway Plus |
Hepatotoxicity | TGFb Signaling Targets |
Hippo Signaling Pathway | Th17 Response |
HIV Host Response (Human ONLY) | Th1 & Th2 |
Homeobox (HOX) Genes | Tight Junctions |
Housekeeping Genes | TNF Signaling Pathway |
Huntington's Disease | Toll-Like Receptor Signaling Pathway |
Hypertension | Transcription Factors |
Hypoxia Signaling Pathway Plus | Transplant Rejection |
Induced Pluripotent Stem Cells | Tumor Metastasis |
IL6/STAT3 Signaling Pathway Plus | Type I Interferon Response |
Immunotoxicity | Tyrosine Kinases |
Inflammasomes | Ubiquitination (Ubiquitinylation) |
Inflammatory Cytokines & Receptors | Ubiquitin Ligases 384HT |
Inflammatory Response & Autoimmunity | Unfolded Protein Response Plus |
Inflammatory Response & Autoimmunity 384HT | VEGF Signaling |
Innate & Adaptive Immune Responses | WNT Signaling Pathway Plus |
Insulin Resistance | WNT Signaling Targets |
Insulin Signaling Pathway | Wound Healing |
Interferons & Receptors | RT2RNA QC |
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