豚鼠实验性变态反应性神经炎模型

　   格林-巴利综合征(GBS)是一种急性多发性神经根病，是神经系统的自身免疫性疾病之一，在世界上分布广泛，尤其在我国，GBS是一种威胁人民健康的常见病，发病率较高，因此，研究GBS的病因、发病机制及其治疗等方面的工作是一项重要的课题。1955年，Waksman等人首次报道将异种动物外周神经组织匀浆物作为过敏原加上完全福氏佐剂(CFA)成功地诱发出兔的实验性变态反应性神经炎(EAN)，多年来的研究表明EAN的许多方面与GBS十分相似，被认为是一种较为理想的动物模型。我们为从神经免疫调节的角度深入探讨GBS的发病机理，用豚鼠建立了EAN动物模型，并对其临床表现、病理改变、电生理指标变化及免疫指标改变等进行了观察。

1　方　法
1.1　动物　选用200～300g雄性纯白豚鼠。
1.2　主要试剂和仪器　标准低分子蛋白(M.W.14000～94000)为Pharmacia公司产品；刀豆素A(ConA)及羊抗豚鼠IgG抗体-HRP为Sigma公司产品；高速分散器(GF-Ⅰ型)为无锡红光分析仪器厂产品；β-计数仪为Beckman公司产品；酶标记比色仪(EL-309型)为Bio-TekInstrument公司产品。
1.3　方法
1.3.1　牛坐骨神经髓鞘碱性蛋白(MBP)的提取与鉴定　①MBP的提取：根据London的方法加以修改。取新鲜牛坐骨神经100g，无菌下分离干净，剪碎，加适量预冷(-4℃)的氯仿/甲醇(2∶1)，高速分散器匀浆，匀浆液加氯仿/甲醇(2∶1)混合液至1000ml，4℃下搅拌12小时，布氏漏斗抽滤脱脂，在沉淀物未抽干前，取出沉淀物再加氯仿/甲醇(2∶1)混合液500ml搅拌2小时，同法抽滤2次，取沉渣加预冷(-4℃)的丙酮500ml，搅拌2小时，抽滤并重复1次。沉渣加双蒸水1000ml，搅拌12小时，抽滤并重复1次，4℃下离心(12500g/min×10min)，去上清液，用180ml双蒸水溶解沉渣，用1mol/LHCl调pH值至3.00，搅拌60分钟，4℃下离心(12500g/min×60min)。取上清液用蒸馏水透析过液，然后用聚乙二醇(PEG：分子量20000)浓缩，置-60℃冰箱内保存备用。上述全过程均在冰浴中进行。②MBP的鉴定：用考马斯亮兰染色法测定蛋白质浓度；用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳法观察蛋白条带。
1.3.2　MBP诱导EAN　取MBP溶液(3mg/ml)1ml，完全福氏佐剂(CFA：含75mg/ml的卡介苗0.5ml，不完全福氏佐剂1.5ml)，置乳钵中碾匀乳化，多点注入豚鼠背部皮下，MBP用量为300μg/只。
1.3.3　EAN发病评分标准　结合国际上EAN评分标准，将发病程度分为0～5级。0级：无异常；1级：两后肢脚趾轻微拖拽地面；2级：两后肢脚趾较明显拖地，但未累及其它部位；3级：两后肢显著拖地，常见两后肢偏向同一侧；4级：两后肢完全瘫痪；5级：四肢均受累，甚至呼吸抑制。
1.3.4　病理形态学观察　①神经组织的HE染色：豚鼠断头处死，迅速取大脑、小脑、脊髓、脊神经根及坐骨神经等，做HE染色。②甲苯胺蓝染色显示神经髓鞘：豚鼠断头处死，取坐骨神经做甲苯胺蓝染色。③单根神经纤维标本的制作：神经组织用10.0%的福尔马林固定，再用1.0%的锇酸固定，在解剖显微镜下撕单根神经纤维光镜下观察。
1.3.5　运动神经传导速度(MNCV)及复合肌肉动作电位的记录　①电极放置位置：近端刺激电极插入坐骨结节附近，远端刺激电极插入踝关节上0.2cm肌肉内，记录电极一支插在掌面肌肉内，一支插在小趾掌趾关节附近，接地电极插在大腿表皮下。②记录方法：豚鼠麻醉，先记录近端复合肌电(PCMAPs)，调整近端刺激电极位置，以持续时间0.05ms、强度35V的刺激能诱发出肌电时的电极位置为最佳，增强刺激强度，至诱发出最大PCMAPs时，再将刺激强度加大50.0%，以此值作为刺激电压值，连续刺激15次，对所诱发的PCMAPs进行摄影并将15次波形重叠在1张胶片上，以重叠最多处为标准，算出PCMAPs潜伏期及波幅大小。同样方法记录出远端复合肌电(DCMAPs)及远端F-波(即紧接DCMAPs的反射波)的潜伏期。根据PCMAPs与DCMAPs潜伏期的差值及两对刺激电极间的距离可算出MNCV。
1.3.6　脾淋巴细胞转化试验　采用微量3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法，丝裂原分别为ConA和MBP。
1.3.7　豚鼠血清中特异性抗MBP-IgG抗体滴度检测　采用ELISA(间接法)方法测得。
1.3.8　统计学处理　实验数据均以均数±标准差()表示，用t检验作两组间差异显著性的比较。