自2013年以来，CRISPR-Cas9 已成为一种炙手可热的基因组编辑工具，但其脱靶效应也让研究界困扰。加利福尼亚大学伯克利分校的研究人员近日给 Cas9 加上了一个开关，让它在指定位点以外的区域保持关闭。

 

改造过的 Cas9 蛋白只有在特定蛋白酶存在的情况下才会被激活，因此被命名为蛋白酶感知 Cas9（ProCas9）。研究人员在 Cas9 中插入一小段蛋白，只能通过癌细胞或病毒 / 细菌所用的酶切割才能激活，从而实现了特定细胞内的基因编辑。

 

这项重要成果于 1 月份发表在《Cell》杂志上。研究人员认为，这种改造让基因组编辑工具变得更安全、更高效，今后有望应用在科研、农业和生物医学中。CRISPR 研究的先驱人物 Jennifer Doudna 也参与了此项研究。

 

 

CRISPR-Cas9 的出现彻底改变了基因组编辑和基因组的功能研究。然而，一系列问题也在阻碍 Cas9 的广泛应用。众所周知，Cas9 始终保持开启状态，这会导致脱靶效应。如果日后应用于体内治疗，它很难实现细胞或组织特异性。此外，它无法与其他蛋白轻松融合。

 

为此，加州大学伯克利分校的 David Savage 及其同事利用环状变换（circular permutation）的方法来改造 Cas9，以便更好地控制其活性，并为融合蛋白创建更好的支架。环状变换可看成用蛋白接头将原来的 N 端和 C 端连在一起，然后在另一处产生新开口。这种 “乾坤大挪移” 可改变蛋白质的稳定性、底物特异性、酶反应速率等。

 

经过这番改造，研究人员发现了四种 Cas9-CP 变体（CP199、CP1029、CP1249、CP1282），其活性为野生型的 80% 或以上。这些结果表明，Cas9 经过环状变换，能够产生 DNA 结合和切割活性与野生型相当的新型蛋白质。

 

之后，他们对 Cas9-CP 实施进一步的改造，将一些植物和人类病毒（如烟草蚀纹病毒 TEV 和人类鼻病毒 3C）蛋白酶的切割位点作为接头序列。这些 5-10 个氨基酸的接头序列完全破坏了 Cas9-CP 的活性，但在加入蛋白酶后又能完全恢复其活性。其中，Cas9-CP199 表现最佳，被用在后续实验中，并被称为蛋白酶感知 Cas9-CP（ProCas9）。

 

接下来，研究人员将 ProCas9 应用在农业和医学相关的病毒上。他们测试了来自芜菁花叶病毒、李痘病毒、马铃薯 Y 病毒以及木薯褐色线条病毒的 Potyvirus 蛋白酶，这些病毒每年造成农作物重大损失。CRISPRi 实验表明各种蛋白酶能够激活各自的 ProCas9。

 

他们还在医学上重要的黄病毒属的蛋白酶上重复了此过程。他们利用寨卡病毒 ZIKV、西尼罗河病毒 WNV、登革热病毒 DENV2 以及黄热病毒 YFV 的核衣壳蛋白 C 切割序列作为接头序列，产生一组黄病毒特异的 ProCas9。他们发现带有 WNV 接头序列的变体能够被寨卡病毒和西尼罗河病毒激活。

 

当然，使用这种基因编辑器的先决条件是它们在稳定表达的条件下具有低的背景活性。为了证实这一点，研究人员构建出了表达 ProCas9 的慢病毒载体，并在 HEK-RT1 报告细胞中检测了 ProCas9Flavi 和 ProCas9Flavi-S6 的活性。在转导后 6-10 天测定，ProCas9 均未表现出任何背景活性，说明此系统没有渗漏。

 

为了验证这种可激活的开关是否在刺激后表现出可重复的诱导，研究人员用表达 dTEV、ZIKV 和 WNV 蛋白酶的载体来瞬时转染含有黄病毒 ProCas9 的 HEK-RT1 报告细胞系。转染后两天，通过强力霉素来诱导 GFP 报告基因，并通过流式细胞仪来定量编辑效率。他们发现，dTEV 蛋白酶表达不会引起基因组编辑，但 ZIKV 和 WNV 蛋白酶活性都实现了基因组编辑。这表明 ProCas9 重组体能够感知和响应黄病毒蛋白酶的活性。

 

在此过程中，研究人员采用赛默飞世尔科技的 Attune NxT 流式细胞仪来定量荧光基团的表达水平以及转染或转导细胞的比例。此外，对于 HEK-RT1 报告细胞系，他们同样采用 Attune NxT 流式细胞仪来定量 GFP 阴性（编辑过）细胞的比例。

 

研究人员推测，ProCas9 背后的机制是接头序列在空间上抑制了活性，导致它们以无活性状态存在于细胞中。识别接头序列的同源蛋白酶通过靶向切割缓解了抑制，使得 ProCas9 恢复活性。

 

研究人员认为，这项成果有望应用在农业和生物医学中，并让 CRISPR-Cas 基因组编辑变得更安全。未来，他们有意开发 Cas9 融合蛋白，用于碱基编辑和表观遗传修饰。他们也有望开发对内源性蛋白酶敏感的 ProCas9，从而编辑癌细胞的基因组。（生物通 余亮）

 

 

CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification

 

Oakes et al., 2019, Cell 176, 254–267