病原感染仍然是威胁全世界人类健康的巨大问题，给临床诊断和治疗带来了沉重负担。临床上传统的病原鉴定主要以培养和生化检测为基础，但随着下一代测序技术的不断进步，宏基因组测序（mNGS）极大的提高了病原检测的效率，并有助于识别难以培养的病原微生物；此外，通过测序识别抗生素抗性微生物也为改善治疗方案提供了依据。然而，mNGS在临床应用方面仍面临诸多障碍，尤其是当检验样品总量少、样本微生物含量低时，如咽拭子样品、支气管肺泡灌洗液样品、血液样品和脑脊液样品等。同时，由于宿主细胞和核苷酸在这些样本中往往占比很大（通常>90%的宿主成分），极大地降低了微生物鉴定的测序效率。

目前，mNGS主要针对病原微生物的DNA，并使用二代测序技术产生较短的序列，因此会忽略一些以RNA为主要遗传物质的病原微生物。即使基于RNA的分析或宏转录组的研究相对较少，但都表明靶向RNA的检测能有效揭示功能活跃的成员/基因；此外，虽然细菌基因组只有几个rDNA拷贝，但rRNA分子含量在活跃细胞中却是极高的，理论上，靶向RNA可以避免占优势但处在休眠的微生物占测序读数的比例。

以Oxford Nanopore Technology测序技术为代表的三代测序拥有快速制备文库及超长读长等优势，能有效提高临床样本中病原的检测。与此同时，ONT直接RNA测序技术也为临床样本中RNA病原无偏的检测提供了可能。至此，中国科学院微生物研究所王军课题组与解放军总医院呼吸与危重症医学部、南方医科大珠江医学院和北京大学第三医院合作，收集了肺泡灌洗液（BALF）、脑脊液（CSF）和血液（Blood）样本，建立了RNA/cDNA靶向测序（mtNGS），以减少临床样本中的宿主核苷酸比例，并通过与牛津纳米孔技术（ONT）相结合（mtTGS）以缩短测序时间。

研究表明，与mNGS相比，mtNGS提高了微生物读数的比例，促进了细菌病原的鉴定，并能对真菌、病毒和抗生素抗性基因进行检测，与传统临床检测结果基本一致。此外，基于ONT的mtTGS由于其较长的读长优势进一步提高了病原微生物的鉴定，也加快了诊断的时间。利用ONT的直接RNA测序和靶向测序的测试表明，ONT显示出重要的病原检测潜力，但仍需进一步发展。因此，这项研究表明靶向RNA的临床样本病原检测有更高的潜力，特别是当与ONT的发展和技术更新相结合时。

上述研究成果已于2021年10月在Advanced Science期刊上发表，中国科学院微生物研究所病原免疫重点实验室助理研究员赵娜、博士生曹佳宝、助理研究员徐嘉悦、北京大学第三医院刘贝贝博士、解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症医学部博士生刘斌、南方医科大学珠江医学院陈定强博士为第一作者，中国科学院微生物研究所王军研究员、南方医科大学珠江医学院周宏伟教授、解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症医学部解立新主任为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、中国科学院先导项目和科技部重点研发计划等项目的经费支持。

参考资料：

1.targeting rna with next- and third-generation sequencing improves pathogen identification in clinical samples